Trabajo sobre Sanfilippo C

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18/2/2015

El síndrome de Sanfilippo C, también conocido como MPS IIIC, es una enfermedad de acúmulo lisosómico causada por mutaciones en el gen HGSNAT, localizado en el cromosoma 8, que presenta una herencia autosómica recesiva. Este gen codifica una proteína de membrana del lisosoma que participa en la vía de degradación del heparán sulfato. Ésta es una molécula que se localiza en la matriz extracelular formando parte de los proteoglicanos y que participa en numerosos e importantes procesos celulares. La disfunción de la proteína HGSNAT promueve el acúmulo de intermediarios de la degradación del heparán sulfato dentro del lisosoma, causando una alteración de múltiples procesos celulares que afecta sobre todo a las neuronas y que provoca la progresiva y severa neurodegeneración que aparece como principal síntoma en los pacientes.

Sanfilippo C     Esta tesis ha representado un importante trabajo para el estudio de las bases moleculares del síndrome de Sanfilippo C. En primer lugar se ha realizado un análisis mutacional que ha permitido identificar las mutaciones que causan la enfermedad en 15 pacientes de diferentes orígenes.


Se han encontrado un total de 13 mutaciones diferentes, 7 de las cuáles no habían sido descritas con anterioridad. Se ha confirmado la patogenicidad de las mutaciones de cambio de aminoácido identificadas comprobando que su presencia hace que la actividad enzimática se reduzca drásticamente. También se ha analizado como las mutaciones que afectan a las regiones conservadas responsables del splicing alteran dicho proceso, el cuál es muy importante para la regulación de la expresión de la mayoría de genes humanos. Además, se han podido identificar dos mutaciones prevalentes en la población española que explican prácticamente un 70% de los casos.

Por otro lado, se han evaluado tres estrategias terapéuticas diferentes como un primer paso en la búsqueda de una terapia efectiva aún no existente para los pacientes de esta enfermedad. La primera opción que se ha evaluado, destinada a pacientes con mutaciones en las secuencias reguladoras del proceso de splicing, ha consistido en la sobreexpresión de U1 snRNAs modificados para poder reconocer mejor las secuencias mutadas . Estos U1 snRNA son pequeñas moléculas de RNA que se encuentran de forma natural dentro de la célula y que regulan el proceso de splicing. Se ha visto que para una mutación determinada y  un U1 snRNAs modificado concreto, hay una recuperación parcial del proceso de splicing correcto en fibroblastos de los pacientes. No obstante, hay que profundizar en el estudio de este tipo de terapia para poder aumentar el nivel de recuperación y conseguir que este incremento se vea plasmado en un aumento de la actividad enzimática, así como evaluar posibles efectos tóxicos. Por otro lado se ha visto que la glucosamina podría ser utilizada como chaperona farmacológica para promover el correcto plegamiento de aquellas proteínas producidas por el gen HGSNAT con mutaciones que introducen pequeños cambios en la secuencia de aminoácidos, aunque los bajos porcentajes de recuperación de la actividad enzimática indican que ésta terapia debería ser utilizada conjuntamente con algún otro tipo de terapia que consiga reducir la producción de heparán sulfato. Éste ha sido el objetivo de la tercera y última aproximación terapéutica que se ha evaluado durante esta tesis y que ha consistido en el uso de siRNAs para inhibir la síntesis del heparán sulfato, concretamente inhibiendo los genes de la familia EXT (en especial EXTL2). Los resultados han indicado una ralentización en la velocidad de acúmulo de heparán sulfato en fibroblastos de diferentes pacientes con el síndrome de Sanfilippo C. Una combinación de estos dos últimos tipos de terapia podría dar mejores resultados, aunque por ahora hay que tener en cuenta que se deberían probar y mejorar estos resultados tanto en modelos celulares como en modelos animales antes de poder plantearse su ensayo en pacientes de MPS IIIC.

Por último, en el transcurso de esta tesis se ha obtenido un modelo neuronal humano de la enfermedad, lo que representa un gran avance en su estudio, ya que hasta el día de hoy no se disponía de ningún modelo celular y no ha sido hasta este mismo año que se ha publicado la obtención de un modelo animal, concretamente un ratón. Para generar el modelo neuronal, se han obtenido células madre pluripotentes inducidas a partir de fibroblastos de dos pacientes con distintos genotipos  mediante una complicada metodología descrita en los últimos años. Posteriormente estas células se han diferenciado a neuronas, que son el tipo celular más afectado en los pacientes. Se ha comprobado que estas neuronas presentan los síntomas característicos de la enfermedad como son la falta de actividad enzimática, un acúmulo de heparán sulfato, el aumento en el número y el tamaño de los lisosomas, una alteración en el proceso de autofagia y un incremento en el número de células en apoptosis. Mediante experimentos específicos que han permitido el estudio de la actividad neuronal de los cultivos obtenidos, se ha visto un descenso progresivo de la actividad en las neuronas de los pacientes, así como problemas en el desarrollo y mantenimiento de las redes neuronales. Además, se han detectado cambios en la conectividad y topología de estas redes neuronales, lo que podría abrir el camino al desarrollo de futuras técnicas que permitan tener un mayor conocimiento de cómo estas enfermedades afectan a los pacientes a un nivel superior al celular. Este modelo va a permitir estudiar más profundamente las bases moleculares, celulares y cerebrales de la enfermedad con el objetivo de poder profundizar en el conocimiento y las posibilidades terapéuticas del síndrome de Sanfilippo C.

Figura. Imagen representativa de un análisis immunocitoquímico de los cultivos neuronales obtenidos en nuestro modelo celular. Éste análisis nos permite diferenciar los tipos celulares debido al marcaje de proteínas específicas de cada tipo celular con anticuerpos fluorescentes. Se pueden ver las neuronas, marcadas específicamente en verde, junto con otros tipos celulares típicos del sistema nervioso marcados en rojo. El color azul nos marca los núcleos de todas las células. Los cultivos neuronales obtenidos de dos pacientes y un control sano pudieron ser comparados y permitieron ver diferencias debidas a la enfermedad en el tipo celular más afectado en los pacientes, las neuronas.


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